AlphaFold AI pomaga przeprojektować białka do edycji genów, zwiększając ich bezpieczeństwo

Rozwój terapii opartych na edycji genów napotykał na wyzwanie związane z bezpieczeństwem. Mimo wysokiej specyficzności systemów, duży rozmiar ludzkiego genomu sprawia, że nawet rzadkie sekwencje DNA mogą pojawić się wielokrotnie, prowadząc do tzw. efektów poza docelowych (off-target effects), czyli edycji niewłaściwych sekwencji. Chociaż prawdopodobieństwo takiego zdarzenia jest niskie, przy edycji wielu komórek błędy stają się nieuniknione. W najnowszym wydaniu czasopisma „Nature” naukowcy opisali, jak zmodyfikowali oprogramowanie AlphaFold do składania białek, aby pomóc w identyfikacji kluczowych obszarów białek odpowiedzialnych za te niepożądane efekty, a następnie je zmodyfikowali, aby zredukować problemy.

Wyzwania w edycji genów i rola białek Cas

Systemy edycji genów składają się z trzech głównych komponentów. Pierwszym jest przewodnikowe RNA, które łączy się z docelową sekwencją genomu. Możliwe jest zaprojektowanie wielu przewodników RNA celujących w ten sam gen, a jednym ze sposobów zwiększenia bezpieczeństwa jest wybór sekwencji, które nie mają wielu podobieństw z innymi lokalizacjami genomicznymi. Jest to obecnie szeroko stosowana praktyka w podstawowym procesie projektowania systemów edycji genów.

Drugim komponentem jest białko Cas, nazwane na cześć białka Cas9 z systemu CRISPR. Oddziałuje ono zarówno z przewodnikiem RNA, jak i genomicznym RNA, pomagając w egzekwowaniu specyficzności interakcji. Jeśli występuje zbyt wiele niedopasowań w parowaniu zasad między RNA a DNA, Cas9 (lub inne białka z rodziny Cas) nie przyczepią się w tym miejscu. Różne podejścia doprowadziły do ulepszenia białek z rodziny Cas, które mają zmniejszoną tendencję do wywoływania edycji poza docelowych.

Ostatnim kluczowym elementem systemu jest białko, które oddziałuje z Cas9, gdy jest ono związane z DNA, i modyfikuje DNA. W oryginalnym systemie CRISPR, białko to przecinało obie nici podwójnej helisy, powodując uszkodzenia trudne do kontrolowania. Od tego czasu naukowcy zmodyfikowali inne białka, aby oddziaływały z Cas9, ale katalizowały bardziej subtelne zmiany w DNA, takie jak odcięcie pojedynczej zasady lub wprowadzenie modyfikacji chemicznych, które zmieniają sposób parowania zasad.

Całkowita długość parowania zasad między przewodnikami RNA a genomem wynosi około 18 zasad. Teoretycznie powinno to pojawiać się w losowych sekwencjach DNA tylko raz na około 70 miliardów zasad, a nasz genom ma tylko około 3 miliardy zasad. Zgodnie z tymi danymi, system powinien być bezpieczny. Okazuje się jednak, że Cas9 może tolerować niewielką liczbę niedopasowanych zasad, nie tracąc zdolności do wiązania się z DNA. Dokładna liczba i lokalizacja zasad, w których tolerowane są wariacje, może się nieco różnić, co utrudnia wcześniejsze zidentyfikowanie, które przewodniki RNA mogą stanowić zagrożenie.

AlphaFold w służbie bezpieczeństwa edycji genów

Zespół badawczy z różnych instytucji w Chinach, stojący za nowymi odkryciami, opracował swoje podejście z wyprzedzeniem. Doskonale dopasowana hybryda DNA-RNA będzie miała jedną strukturę, podczas gdy ta z jedną lub więcej niedopasowanymi zasadami będzie miała nieco inną strukturę. Ewolucja zoptymalizowała strukturę Cas9 tak, aby wiązała się z tą pierwszą. Jednak najwyraźniej nie zapobiegło to przyjęciu przez Cas9 nieco innych konformacji, które mogą oddziaływać z niedopasowanymi strukturami. Zidentyfikowanie części Cas9, które pośredniczą w tych problematycznych interakcjach, pozwala na ich modyfikację i potencjalne zablokowanie.

Pierwszym krokiem zespołu było zbudowanie obszernej biblioteki miejsc edycji poza docelowych. Użyli do tego zmodyfikowanego systemu CRISPR, który przekształca zasadę DNA adeninę w inozynę, a następnie izolowali wszelkie fragmenty DNA, które ją zawierały. Powtórzyli ten proces z 10 różnymi przewodnikami RNA i przeanalizowali dużą liczbę zmodyfikowanych fragmentów DNA z każdego, aby uzyskać szeroki obraz typów obecnych sekwencji poza docelowych.

Następnym krokiem było zbadanie, jak kompleks CRISPR oddziałuje z nimi, wykorzystując oprogramowanie AlphaFold AI do składania białek. Uaktualnione wersje zostały zaprojektowane do obsługi interakcji między białkami a kwasami nukleinowymi, a także kompleksów wielu białek. Zespół wprowadził do AlphaFold wersje docelowej sekwencji DNA, wraz z przewodnikiem RNA, sekwencją Cas9 i enzymem, który chemicznie modyfikuje zasady i może wiązać się z Cas9. Początkowo oprogramowanie miało problemy, umieszczając jedno z białek w ewidentnie niewłaściwej lokalizacji. Nie zrażając się, zespół uprościł dane wejściowe, podając AlphaFold tylko DNA, RNA i białko Cas9, ponieważ to ostatnie jest głównym czynnikiem determinującym specyficzność sekwencji. To podejście zadziałało znacznie lepiej, generując strukturę zgodną z wynikami eksperymentów z rzeczywistymi kwasami nukleinowymi i białkami.

Porównując struktury wygenerowane przez AlphaFold dla różnych miejsc docelowych i poza docelowych, naukowcy odkryli ogólny wzorzec. Wiele (około dwóch trzecich) miejsc poza docelowych powodowało, że białko Cas9 przyjmowało nieco inną strukturę. Jednak prawie wszystkie (ponad 95 procent) z nich zmieniały, które aminokwasy kontaktowały się z RNA. Oznacza to, że istnieją przypadki, w których Cas9 zachowuje swoją normalną strukturę, ale aminokwasy w nim uginają się w sposób, który dostosowuje się do niedopasowanych zasad w miejscach poza docelowych.

AlphaFold był już skonfigurowany do identyfikacji tzw. „prawdopodobieństwa kontaktu”, czyli szansy, że dwa elementy, takie jak aminokwasy lub nukleotydy, znajdują się w bardzo małej odległości (ośmiu Angstromów). Naukowcy mogli porównać wyniki analizy prawdopodobieństwa kontaktu dla miejsc docelowych i poza docelowych, identyfikując dokładnie, które aminokwasy w Cas9 miały zmienione kontakty, gdy występowało niedopasowanie między przewodnikiem RNA a DNA. Nazwali ten komputerowy system analizy „ContactSeek”.

Modyfikacja białek i przyszłe perspektywy

Sam ContactSeek generował długą listę aminokwasów, które przemieszczały się po związaniu z miejscem poza docelowym. Naukowcy skupili się więc na regionach białka Cas9, gdzie te aminokwasy gromadziły się, uznając to za znak, że te obszary dostosowują się do różnic spowodowanych niedopasowanymi zasadami. Następnie zaczęli testować wersje Cas9 z różnymi aminokwasami w tych miejscach.

Łącznie naukowcy dokonali 23 różnych zamian, wprowadzając inny aminokwas w jedną z 10 kluczowych pozycji zidentyfikowanych dzięki pracy z AlphaFold. Pozwoliło im to znaleźć wariant o aktywności podobnej do normalnego Cas9 w miejscach zgodnych z docelową sekwencją, podczas gdy jego aktywność poza docelowa spadła z 28 procent do 5 procent. Podobne wyniki uzyskano, gdy naukowcy użyli różnych przewodników RNA. Wykazali również, że podejście to działało dla podobnego systemu, który wykorzystywał inne białko Cas (Cas12) do rozpoznawania kombinacji DNA/przewodnik RNA.

Inne zespoły badawcze stosowały różne podejścia, takie jak ewolucja kierowana, do opracowania wariantów Cas9, które są mniej podatne na edycję poza docelową. W porównaniu z tymi wariantami, nowo zaprojektowane wersje wykazywały podobną, a nawet nieco lepszą aktywność i specyficzność. Duża różnica polega na tym, że zmiany zidentyfikowane przez to podejście mogą być bardziej specyficzne dla danej kombinacji przewodnik RNA/niedopasowanie, niż bardziej ogólnie skuteczne. Niektóre z indywidualnych zmian zidentyfikowanych w tej pracy mogłyby potencjalnie zostać połączone z tymi z wcześniej opracowanych wersji Cas9, aby uzyskać jeszcze większe ulepszenia, choć nie zostało to przetestowane.

Praca ta jest potencjalnie użyteczna, ponieważ opisuje ogólną metodę wytwarzania systemów edycji genów dostosowanych do zapobiegania znanym zdarzeniom poza docelowym. Jeśli okaże się to wąskim gardłem w rozwoju terapii, praca ta może być znaczącym przełomem. Naukowcy sugerują również, że podejście to będzie przydatne bardziej ogólnie do precyzyjnego dostrajania interakcji białko-DNA, co może mieć zastosowania daleko wykraczające poza edycję genów.

Źródło: arstechnica.com